实验原理
细胞在非变性条件下被裂解时,细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离,对B蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。
技术应用
1.在体内验证两个蛋白质相互作用
2.在体内筛选和目的蛋白互作的未知蛋白
基本流程
技术优势
(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
(3)可分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
结果展示
图示为验证蛋白A与蛋白B是是否存在相互作用的结果图。由图可以发现,该实验被分为两组:Input组及IP组。由Input组得到结论:蛋白A与蛋白B都是存在的。IP组中IgG是阴性对照,用于排除蛋白与抗体非特异性结合,蛋白A与蛋白B没有被沉淀下来;IP组protein A表示用蛋白A的抗体进行沉淀实验,结果蛋白A被沉淀下来,蛋白B也被沉淀下来,结论:蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。
样品要求
1、需检测的样品,一抗。
2、送样要求:
▶ 离体后迅速超低温处理并-80℃冻存的组织样品,干冰运输;
▶ 组织:动物组织不少于400 mg;植物组织不少于2 g;
▶ 细胞:2x10^7个细胞。